مجتمع تکثیر-رونویسی کرونا: NMPylation مهم و انتخابی زیرواحدهای NiRAN-RdRp به مکان‌های حفاظت‌شده در nsp9

ویرایش شده توسط پیتر سارنو، دانشکده پزشکی دانشگاه استنفورد، دانشگاه استنفورد، کالیفرنیا، تایید شده در 25 دسامبر 2020 (بازبینی شده در 25 اکتبر 2020)

ما تعامل بین زیر واحدها را در تکثیر کمپلکس‌های رونویسی-کروناویروس گزارش می‌کنیم که برای همانندسازی و حفظ تکاملی ضروری هستند.ما شواهدی ارائه کردیم مبنی بر اینکه دامنه NiRAN مرتبط با nsp12 دارای فعالیت ترانسفراز نوکلئوزیدی مونوفسفات (NMP) در ترانس است و nsp9 (یک پروتئین اتصال RNA) را به عنوان هدف آن شناسایی کردیم.NiRAN در واکنشی که به یونهای Mn2+ و باقیمانده های Asn حفاظت شده مجاور متکی است، اتصال کووالانسی نصفه NMP را به پایانه آمینه nsp9 حفظ شده کاتالیز می کند.مشخص شد که فعالیت NiRAN و NMPylation nsp9 برای تکثیر ویروس کرونا ضروری هستند.داده‌ها به ما اجازه می‌دهند که این فعالیت نشانگر آنزیم ویروس تودرتو را به مشاهدات قبلی در این فرضیه که شروع سنتز RNA در دسته‌ای از ویروس‌های RNA از نظر عملکردی و تکاملی سازگار است، مرتبط کنیم.

RNA پلیمراز وابسته به RNA (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae، Arterioviridae و 12 خانواده دیگر) به دامنه آمینو پایانی (N-ترمینال) در پروتئین غیر ساختاری (nsp) آزاد شده از پلی پروتئین به نام NiRAN مرتبط است. 1ab از پروتئاز اصلی ویروسی (Mpro) تشکیل شده است.قبلاً، فعالیت GMPylation/UMPylation خود ویروس شریانی NiRAN-RdRp nsp گزارش شده بود، و پیشنهاد شده بود که برای انتقال مونوفسفات نوکلئوزید (NMP) به ویروس (در حال حاضر ناشناخته) و/یا چیزهای بیوپلیمریزاسیون سلولی، گذرا ایجاد شود.در اینجا، نشان می‌دهیم که ویروس کرونا (Human Coronavirus [HCoV]-229E و سندرم حاد تنفسی شدید Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) دارای فعالیت NMPylation وابسته به Mn2+ است که از nsp9 از طریق تشکیل nsp9 با واسطه Mpro مشتق شده است. nsps طرفین ترمینال N به طور پروتئولیتی آزاد می شود، فسفورامیدات به آمین اولیه (N3825) در ترمینال N nsp9 متصل می شود.اوریدین تری فسفات نوکلئوتید ارجح در این واکنش است، اما آدنوزین تری فسفات، گوانوزین تری فسفات و سیتیدین تری فسفات نیز سوبستراهای مشترک مناسبی هستند.مطالعات جهش با استفاده از پروتئین‌های nsp9 و nsp12 کروناویروس نوترکیب و جهش‌های HCoV-229E با مهندسی ژنتیک، باقیمانده‌های لازم برای NMPylation nsp9 با واسطه NiRAN و تکثیر ویروس در کشت سلولی را تعیین کردند.داده ها پیش بینی باقی مانده های سایت فعال NiRAN را تایید کردند و نقش مهم باقی مانده های nsp9 N3826 را در nsp9 NMPylation و تکثیر ویروس در شرایط آزمایشگاهی تعیین کردند.این باقیمانده بخشی از توالی تری پپتیدی NNE ترمینال حفظ شده است و ثابت شده است که تنها باقی مانده ثابت nsp9 و همولوگ های آن در خانواده کروناویروس است.این مطالعه یک پایه محکم برای مطالعه عملکردی فعالیت NMPylation سایر ویروس‌های تودرتو فراهم می‌کند و اهداف احتمالی را برای توسعه داروهای ضد ویروسی پیشنهاد می‌کند.

ویروس RNA رشته مثبت Nidovirales انواع مهره داران و بی مهرگان را آلوده می کند (1، 2).این سفارش در حال حاضر شامل 14 خانواده (3) است که خانواده کروناویروس در 20 سال گذشته به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است.در آن زمان، سه کروناویروس مشترک بین انسان و دام از میزبان حیوانات پدید آمد و باعث شیوع گسترده عفونت‌های تنفسی شدید در انسان شد.از جمله پاندمی های پایدار ناشی از بیماری های عفونی حاد شدید.سندرم تنفسی Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).نیدویروس ها یک سازمان ژنومی مشترک دارند و زیرواحد کمپلکس تکثیر-رونویسی متصل به غشاء (RTC) در دو سوم ترمینال 5-?² و زیرواحد ساختاری اصلی ذره ویروس و همچنین برخی از لوازم جانبی کدگذاری شده است. .پروتئین، کدگذاری شده در یک سوم انتهایی 3/2 ژنوم (1).به جز یک خانواده از ویروس‌های پلاری (Monoviridae) (8)، همه ویروس‌های تودرتو زیرواحدهای RTC را در دو فریم خواندن باز بزرگ (ORF) ORF1a و ORF1b رمزگذاری می‌کنند که از RNA ژنومی ترجمه شده‌اند.ORF1a پلی پروتئین (pp) 1a را کد می کند و ORF1a و ORF1b به طور مشترک pp1ab را کد می کنند.با مشارکت کلی پروتئاز اصلی (Mpro) کدگذاری شده توسط ORF1a، هر دو pp1a و pp1ab به صورت پروتئولیتیکی به انواع پروتئین های غیرساختاری (nsps) که به عنوان 3CLpro نیز شناخته می شوند، پردازش می شوند، زیرا با 3Cpro ویروس پیکورناویروس همسانی دارد. 9).تصور می‌شود که این nsps در یک RTC دینامیکی بزرگ جمع می‌شوند، سنتز RNA ژنومی (تکثیر) و مجموعه‌ای از RNA زیر ژنومی (رونویسی) را کاتالیز می‌کنند و برای هماهنگ کردن بیان ORF واقع در پایین دست ORF1b استفاده می‌شوند (10?? ?12).

هسته RTC شامل RNA پلیمراز وابسته به RNA (RdRp) (13)، سوپرخانواده 1 هلیکاز (HEL1) (14، 15) و چندین آنزیم پردازش RNA است که عمدتاً در ORF1b کدگذاری شده اند و در خانواده کروناویروس ها حاوی nsp12-nsp16 و nsp9-nsp12 در خانواده Arterioviridae (به مرجع 10ââ 12 مراجعه کنید).RdRp و HEL1 نشان دهنده دو (یک پنجم) دامنه حفاظت شده از ویروس لانه پرنده هستند و همسانی در میان سایر ویروس های RNA دارند.اعتقاد بر این است که کپی هسته توسط زیرواحدهای دیگر، از جمله چندین nsps کوچک آزاد شده از ناحیه کربوکسی ترمینال (C-ترمینال) pp1a، پایین دست Mpro (به ترتیب nsp5 و ویروس شریانی nsp4) کمک می کند.آنها حفاظت خاص خانواده و فعالیت های متنوع محدودی دارند (در مرجع 10ââ12 بررسی شده است).

اخیراً، دامنه‌ای با ویژگی‌های موتیف توالی منحصربه‌فرد در انتهای آمینه (N-پایانه) مجاور RdRp در همه ویروس‌های تودرتو یافت شد، اما هیچ ویروس RNA دیگری وجود نداشت (16).بر اساس مکان و فعالیت نوکلئوتید ترانسفراز (نوکلئوزید مونوفسفات [NMP] ترانسفراز)، این دامنه NiRAN (ترانسفراز نوکلئوتیدی مرتبط با Nestvirus RdRp) نامیده می شود.ترکیب دو دامنه ای NiRAN-RdRp nsp12 در خانواده Coronaviridae و nsp9 در خانواده Arterioviridae را تشکیل می دهد و در سایر nestoviridae انتظار می رود NiRAN-RdRp به عنوان یک nsp مستقل از پلی پروتئین ویروسی منتشر شود.در ویروس کرونا، دامنه NiRAN حاوی ?1/450 باقی مانده است و از طریق ناحیه پیوند دهنده به دامنه RdRp ترمینال C متصل می شود (16?19).در ویروس آرتریت اسب (EAV) (Arteriviridae)، nsp9 نوترکیب فعالیت‌های UMPylation و GMPylation وابسته به یون Mn2+ را نشان می‌دهد که به سه پایگاه توالی حفظ‌شده در نستوویروس، AN، BN و CN باقی‌مانده‌های توالی بستگی دارد.جایی که N مخفف NiRAN است) (16).طرفین ترمینال N این نقوش یک موتیف کمتر محافظه کارانه preAN است.برخی از این باقیمانده ها همچنین در پروتئین کینازهای مرتبط با هم حفظ می شوند، جایی که نشان داده شده است که در اتصال و فعالیت کاتالیزوری نوکلئوزید تری فسفات (NTP) نقش دارند (20، 21).مطابق با این مشاهدات، چندین باقیمانده سایت فعال کلیدی در pseudokinase SelO از Pseudomonas syringae را می توان با ابرمجموعه SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 که اخیراً منتشر شده است، جمع آوری کرد.باقی مانده‌های NiRAN ویروس کرونا در ریزساختار الکترونی قرار گرفته است.پروتئین نوترکیب (17).حدس زده می شود که U/GMPylation مستند شده (خود) یک حالت گذرا برای انتقال NMP به بستر (در حال حاضر ناشناخته) ایجاد می کند (16)، و شباهت ساختاری بین NiRAN و پروتئین کیناز (17، 19) این فرضیه است که NiRAN پروتئین های دیگر را اصلاح می کند.

بسیاری از ویژگی‌ها، از جمله ارتباط سیستماتیک منحصربه‌فرد آن با ویروس‌های تودرتو و جداسازی ژنتیکی از RdRp، NiRAN را به یک آنزیم تنظیم‌کننده کلیدی معقول برای ویروس‌های تودرتو تبدیل می‌کند که برای ظهور و هویت آن‌ها حیاتی است.پیش از این، سه عملکرد ممکن شامل NiRAN برای تنظیم ترجمه ژنوم/زیر ژنومی یا همانندسازی/رونویسی نامیده شد.هنگام در نظر گرفتن داده های کمیاب و ناقص موجود در آن زمان، هر تابع مزایا و معایب خود را دارد (16).در این تحقیق، هدف ما ترکیب مطالعات بیوشیمیایی و ژنتیکی معکوس کروناویروس‌های دو جنس است و یافته‌های خود را در زمینه تکاملی جهش طبیعی خانواده کروناویروس قرار می‌دهیم تا بینشی در مورد این قلمرو اسرارآمیز به دست آوریم.ما پیشرفت‌های عمده در درک NiRAN را از طریق شناسایی اهداف طبیعی در RTC گزارش می‌کنیم که (در میان سه فرضیه موجود) به نقش این دامنه در شروع سنتز RNA ویروس تودرتو کمک می‌کند.این تحقیق همچنین امکانات دیگری را برای نقش‌های NiRAN در رابط میزبان ویروس باز می‌کند.

به منظور مشخص کردن ویژگی‌های آنزیمی دامنه NiRAN مرتبط با ویروس کرونا nsp12، یک شکل نوترکیب از ویروس کرونای انسانی 229E (HCoV-229E) nsp12 در E. coli با یک برچسب His6 در انتهای C تولید کردیم و پروتئین با [α32-P] همراه با NTP در حضور MnCl2 همانطور که در مواد و روش ها توضیح داده شده است، جوجه کشی کنید.تجزیه و تحلیل محصول واکنش نشان دهنده وجود یک پروتئین نشاندار شده با رادیواکتیو است که با nsp12 (106 کیلو دالتون) مهاجرت می کند، که نشان می دهد nsp12 کروناویروس تشکیل ترکیبات افزایشی پروتئین-NMP کووالانسی را کاتالیز می کند که ترجیحاً با یوریدین مونوفسفات (UMP) تشکیل می شوند (شکل 1A) و ب).تجزیه و تحلیل کمی نشان داد که در مقایسه با سایر نوکلئوتیدها، شدت سیگنال ادغام UMP 2 تا 3 برابر افزایش یافت (شکل 1C).این داده‌ها با فعالیت NMP ترانسفراز پیش‌بینی‌شده دامنه NiRAN کروناویروس مطابقت دارد (16)، اما نشان می‌دهد که ترجیحات نوکلئوتیدی دامنه NiRAN ویروس کرونا و ویروس شریانی متفاوت است.

فعالیت خود NMPylation HCoV-229E nsp12.(الف) HCoV-229E nsp12-His6 (106 کیلو دالتون) با NTP تعیین شده [α-32P] در حضور 6 میلی مولار MnCl2 به مدت 30 دقیقه انکوبه شد (برای جزئیات به مواد و روش ها مراجعه کنید).محصولات واکنش توسط SDS-PAGE جدا شده و با رنگ آبی درخشان Coomassie رنگ آمیزی شدند.(ب) پروتئین نشاندار شده رادیویی با تصویربرداری فسفر قابل مشاهده است.موقعیت نشانگرهای جرم مولکولی nsp12-His6 و پروتئین (بر حسب کیلودالتون) در A و B نشان داده شده است. (C) شدت سیگنال رادیواکتیو (میانگین ± SEM) از سه آزمایش مستقل تعیین شد.*P≤0.05.قدرت سیگنال (درصد) مربوط به UTP است.

اگرچه نشان داده شده است که فعالیت های آنزیمی مرتبط با NiRAN برای تکثیر EAV و SARS-CoV در کشت سلول ضروری است (16)، عملکرد خاص NiRAN و اهداف بالقوه هنوز مشخص نشده است.شباهت ساختاری اخیراً گزارش شده بین NiRAN و خانواده ای از پروتئین ها با چین های شبیه پروتئین کیناز (17، 22) ما را بر آن داشت تا این فرضیه را آزمایش کنیم که NiRAN NMPylation سایر پروتئین ها را کاتالیز می کند.ما مجموعه‌ای از اهداف همولوگ بالقوه تولید کردیم، از جمله پروتئین‌های غیرساختاری کدگذاری شده توسط HCoV-229E ORF1a (nsps 5، 7، 8، 9، 10)، که هر کدام حاوی یک برچسب His6 ترمینال C (ضمیمه SI، جدول S1) و این پروتئین ها را با [α32-P] یوریدین تری فسفات ([α32-P]UTP) در حضور یا عدم حضور nsp12 انکوبه کنید.آلبومین سرم گاوی و پروتئین فیوژن MBP-LacZα تولید شده در E. coli به عنوان شاهد استفاده می شوند (شکل 2A، خطوط 1 تا 7).پروتئین نشاندار شده توسط ژل الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) و اتورادیوگرافی آنالیز شد و مشخص شد که سیگنال رادیواکتیو قوی در واکنش حاوی nsp12 و nsp9 وجود دارد.موقعیت سیگنال مربوط به جرم مولکولی nsp9 است که نشان دهنده UMPylation با واسطه nsp12 nsp9 است (شکل 2B، مسیر 7).هیچ پروتئین آزمایشی دیگری یافت نشد که UMPylated باشد، که ما را به این نتیجه رساند که nsp9 یک بستر خاص از nsp12 است.مطابق با داده های خود NMPylation نشان داده شده در شکل 1، nsp12 قادر است هر چهار NMP را به nsp9 منتقل کند، اگرچه کارایی متفاوت است، UMP> آدنوزین مونوفسفات (AMP)> گوانوزین مونوفسفات (GMP)> سیتیدین مونوفسفات (CMP) تصویر).3 الف و ب).تحت شرایط مورد استفاده در این سنجش (کوتاه کردن واکنش و زمان قرار گرفتن در معرض، کاهش غلظت nsp12، مواد و روش‌ها)، خود NMPylation nsp12 قابل تشخیص نیست (شکل 2B، خط 7، و شکل 1B را مقایسه کنید). ثابت کرد که یک UMP موثر (و چند دور) از nsp12 به nsp9 منتقل شد.فعالیت UMP ترانسفراز نیاز به حضور یونهای Mn2+ دارد، همانطور که در شکل 3C نشان داده شده است، در حالی که تنها حداقل فعالیت ترانسفراز UMP در حضور Mg2+ مشاهده شد و هیچ فعالیتی در حضور دو کاتیون دو ظرفیتی دیگر مورد آزمایش قرار نگرفت.داده های مشابهی در سنجش NMPylation حاوی سیتیدین تری فسفات (CTP)، گوانوزین تری فسفات (GTP) و آدنوزین تری فسفات (ATP) (ضمیمه SI، شکل S1) به دست آمد.

HCoV-229E nsp12 UMPylation nsp9 با واسطه.یک سری از سوبستراهای پروتئینی (شامل آلبومین سرم گاوی، MBP-lacZα، و یک سری HCoV-229E nsps برچسب‌گذاری شده با C-ترمینال His6 کدگذاری شده توسط ORF1a) برای ارزیابی فعالیت UMPylation HCoV-229E nsp12-His6-mediated استفاده شد. پروتئینپروتئین را با [α-32P] UTP به مدت 10 دقیقه در غیاب (A) یا حضور (B) nsp12 همانطور که در مواد و روش ها توضیح داده شده است، انکوبه کنید.در بالای A و B، ژل SDS-پلی آکریل آمید رنگ آمیزی شده با Coomassie Brilliant Blue نشان داده شده است و در پایین A و B، اتورادیوگرام های مربوطه نشان داده شده است.موقعیت نشانگر جرم مولکولی پروتئین (به کیلودالتون) در سمت چپ آورده شده است.موقعیت nsp12-His6 (B، بالا) و سیگنال رادیواکتیو مشاهده شده در طول انکوباسیون nsp12-His6 با nsp9-His6 (B، خط 7) نیز نشان داده شده است، که نشان می دهد [α-32P]UMP به nsp9-His6 (12.9 کیلو دالتون)، که برای سایر پروتئین های آزمایش شده مشاهده نشد.

شناسایی بیوشیمیایی و ویروسی nsp9 NMPylation با واسطه HCoV-229E NiRAN.(الف و ب) نقش سوبسترای نوکلئوتیدی مورد استفاده در واکنش.Nsp12-His6 و nsp9-His6 در حضور NTP های مختلف [α-32P] در روش استاندارد NMPylation مخلوط و انکوبه می شوند.(A، بالا) nsp9-His6 رنگ آمیزی شده با Coomassie توسط SDS-PAGE جدا شده است.(A، پایین) اتورادیوگرافی همان ناحیه ژل.(B) فعالیت نسبی (میانگین ± SEM) در حضور کوفاکتور نوکلئوتیدی تعیین شده از سه آزمایش مستقل تعیین می شود.*P≤0.05.ج) نقش یون های فلزی.آزمایش استاندارد NMPylation در حضور [α-32P] UTP و یون های فلزی مختلف، هر کدام با غلظت 1 میلی مولار نشان داده شده است.در C، بالا، nsp9-His6 رنگ آمیزی شده با Coomassie نشان داده شده است، و در C، پایین، اتورادیوگرافی مربوطه نشان داده شده است.اندازه پروتئین نشاندار شده (به کیلودالتون) در سمت چپ A و C نشان داده شده است. (D) شکل جهش یافته HCoV-229E nsp12-His6 حامل جایگزینی اسید آمینه مشخص شده در [α-32P]UTP است، همانطور که توضیح داده شد. در مواد و روش هاnsp9-His6 نشاندار شده رادیویی تولید شده در واکنش NMPylation با تصویربرداری فسفوریلاسیون (D، بالا) شناسایی می شود.فعالیت نسبی در مقایسه با پروتئین نوع وحشی (wt) در D نشان داده شده است، و پایین به عنوان میانگین (±SEM) از سه آزمایش مستقل گرفته شده است.ستاره ها نشان دهنده جایگزینی باقیمانده های حفظ نشده است.(E) تیتر ویروس در رویی کشت سلولهای p1 بدست آمده 24 ساعت پس از عفونت با روش پلاک تعیین شد.جایگزینی کدون در حوزه NiRAN جهش HCoV-229E مهندسی شده نشان داده شده است (شماره‌گذاری باقیمانده بر اساس موقعیت آنها در pp1ab است).جهش یافته سایت فعال RdRp با کمبود تکثیر nsp12_DD4823/4AA به عنوان شاهد استفاده شد.

به منظور به دست آوردن درک عمیق تر از سایت فعال NiRAN و تعیین بقایای مربوط به فعالیت NMP ترانسفراز اختصاصی nsp9، ما آنالیز جهش را انجام دادیم که در آن بقایای محافظه کارانه را در موتیف های NiRAN AN، BN و CN جایگزین کردیم. 16) Ala است (ضمیمه SI، شکل S2).علاوه بر این، تاثیر جایگزینی محافظه کارانه Arg-to-Lys یا Lys-to-Arg در دو مورد مورد ارزیابی قرار گرفت.به‌عنوان یک کنترل (منفی)، باقی‌مانده‌هایی که در دامنه NiRAN ویروس‌ها و سایر ویروس‌های تودرتو حفظ نشده‌اند یا کمتر حفظ شده‌اند، با Ala جایگزین می‌شوند. جایگزین K4116A (در موتیف preAN)، K4135A (AN)، R4178A (BN)، D4188A (موتیف) BN) و D4280A (CN) به طور قابل توجهی nsp9 NMPylation را از طریق nsp12 کاهش می دهد یا حتی حذف می کند، در حالی که پروتئین های با جایگزینی محافظه کارانه (R4178K)، K4116R) 60٪ و 80٪ از فعالیت خود را حفظ می کنند، که نشان می دهد که کاهش محدودیت ها در سمت مربوطه خود زنجیر از نظر فیزیکی و شیمیایی حساس است (شکل 3D).جایگزینی چندین باقیمانده حفاظت شده دیگر E4145A، D4273A، F4281A و D4283A بسیار کمتر مضر است و nsp9 UMPylation فقط به میزان متوسطی کاهش می یابد.نتایج مشابهی در واکنش‌های NMPylation nsp9 که شامل سایر NTP‌ها می‌شود (شکل 3D و ضمیمه SI، شکل S3) به دست آمد که تأیید می‌کند که اثرات مشاهده‌شده بر روی جایگزین‌های اسید آمینه خاص مستقل از نوع سوبسترای نوکلئوتیدی مورد استفاده است.سپس، تأثیر احتمالی این جایگزینی‌های nsp12 را بر تکثیر کروناویروس‌ها در کشت سلولی آزمایش کردیم.برای این منظور، ما از الگوهای DNA مکمل (cDNA) مهندسی ژنتیکی مناسب شبیه‌سازی شده در ویروس واکسینیا نوترکیب (23، 24) برای رونویسی 5-7 سلول استفاده کردیم.تیتراسیون نتاج ویروس های عفونی تولید شده در این سلول ها نشان داد که اکثر موتانت های NiRAN HCoV-229E امکان پذیر نیستند (شکل 3E).گروهی از جهش‌یافته‌های ویروسی غیرقابل زنده شامل جایگزین‌هایی هستند که نشان داده شده است فعالیت NMP ترانسفراز را در شرایط آزمایشگاهی حذف یا کاهش می‌دهند (K4116A، K4135A، R4178A، D4188A، ​​D4280A، D4283A)، اما دو جایگزین دیگر وجود دارد (K4116R، E4145A) ٪ رزرو شده است؟فعالیت NMPylation در شرایط آزمایشگاهی آن‌ها نشان می‌دهد که محدودیت‌های اضافی درگیر هستند.به طور مشابه، دو جهش دیگر (R4178K، F4281A) که باعث کاهش متوسط ​​در فعالیت NMPylation در شرایط آزمایشگاهی NiRAN شدند، ویروس‌های زنده تولید کردند، با این حال، این ویروس‌ها به طور قابل‌توجهی تیتر را از طریق همانندسازی کاهش دادند.مطابق با داده‌های فعالیت آزمایشگاهی نشان‌داده‌شده در شکل 3D، جایگزینی چهار باقیمانده دیگر که در ویروس کرونا و/یا سایر ویروس‌های تودرتو حفظ نشده‌اند (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ویروس‌های زنده‌ای تولید کرد. یک تیتر نسبتاً کاهش یافته در مقایسه با ویروس نوع وحشی (شکل 3E).

به منظور بررسی اینکه آیا فعالیت NMP ترانسفراز با واسطه NiRAN به دامنه فعال RdRp بستگی دارد، دو باقیمانده Asp حفاظت شده که در هماهنگی یون های فلزی دو ظرفیتی (11) در موتیف RdRp C نقش دارند با Ala جایگزین شدند. پروتئین حاصل nsp12_DD4823/4AA حفظ می شود. فعالیت nsp9 NMPylation آن، نشان می دهد که فعالیت in vitro nsp9 NMPylation با واسطه nsp12 نیازی به فعالیت پلیمراز ندارد (ضمیمه SI، شکل S4).

پس از ایجاد فعالیت NMP ترانسفراز اختصاصی nsp9 برای nsp12، ما سعی کردیم ترکیب اضافی NMP-nsp9 را با استفاده از طیف سنجی جرمی (MS) مشخص کنیم.طیف جرمی پروتئین کامل HCoV-229E nsp9 نوترکیب، اوج خود را در 12045 Da نشان داد (شکل 4A).افزودن nsp12 کیفیت nsp9 را تغییر نداد و نشان می‌دهد که nsp12 و nsp9 در شرایط مورد استفاده (دناتوراسیون) یک کمپلکس پایدار تشکیل نمی‌دهند (شکل 4A).در حضور UTP و GTP، اندازه‌گیری جرم واکنش حاوی nsp9 و nsp12 به ترتیب نشان داد که جرم پروتئین UTP 306 Da و جرم پروتئین GTP 345 Da حرکت می‌کند، که نشان می‌دهد هر مولکول nsp9 به یک UMP یا GMP متصل می‌شود. (تصویر 4) ج و د).حدس زده می شود که انرژی مورد نیاز برای nsp9 NMPylation با واسطه NiRAN از هیدرولیز NTP و انتشار پیروفسفات حاصل می شود.اگرچه در این واکنش از nsp9 (هدف) بیش از 10 برابر بیشتر از nsp12 (آنزیم) استفاده شد، NMPylation تقریباً کامل nsp9 مشاهده شد که نشان می‌دهد تعامل بین nsp12 و nsp9 کوتاه‌مدت است و nsp12 می‌تواند nsp9 بیشتری را NMPylate کند. مولکول آزمایشگاهی

NMPylation منفرد nsp9 در حضور nsp12 و UTP یا GTP.طیف جرمی پروتئین کامل پیچیده HCoV-229E nsp9 نشان داده شده است (ضمیمه SI، جدول S1) (AD).(A) nsp9 به تنهایی، (B) nsp9 + nsp12-His6، (C) nsp9 + nsp12-His6 در حضور UTP، (D) nsp9 + nsp12-His6 در حضور GTP.

برای تعیین باقی‌مانده‌های nsp9 UMPylated توسط nsp12، nsp9-UMP با تریپسین شکسته شد.پپتیدهای به دست آمده توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) جدا شدند و با طیف سنجی جرمی پشت سر هم (MS/MS) آنلاین تجزیه و تحلیل شدند.تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از بسته نرم افزاری Byonic (Protein Metrics) UMPylation اسید آمینه N ترمینال را نشان داد.این به صورت دستی تایید می شود.طیف جرمی پشت سر هم از پپتید پیش ساز [UMP] NNEIMPGK (ضمیمه SI، شکل S5A) قطعه ای را در m/z 421 نشان داد، که نشان می دهد UMP به باقی مانده 1 nsp9 متصل می شود.

در انتهای N nsp9، Asn در بین اعضای Orthocoronavirinae حفظ می شود (ضمیمه SI، شکل S6).اگرچه ما معتقدیم که نیتروژن آمین اولیه N ترمینال محتمل ترین پذیرنده برای UMP است، تصمیم گرفتیم شواهد بیشتری از اتصال NMP در ترمینال N به دست آوریم.به همین دلیل، پپتید N-ترمینال غیر NMPylated و NMPylated nsp9 خالص شده توسط HPLC در حضور استون و سیانوبرو هیدرید سدیم به دست آمد.تحت این شرایط، فقط آمین های اولیه آزاد را می توان با پروپیل اصلاح کرد (25).پپتید N ترمینال مشتق از nsp9 با دنباله NNEIMPGK حاوی دو آمین اولیه است، یکی در انتهای N Asn و دیگری در زنجیره جانبی Lys در انتهای C.بنابراین، گروه های پروپیل را می توان در هر دو انتها معرفی کرد.کروماتوگرام های یونی استخراج شده پپتیدهای غیر NMPylated در پیوست SI، شکل S5B نشان داده شده است.همانطور که انتظار می رود، پپتیدهای N ترمینال و C (مونو) پروپیله شده (ضمیمه SI، شکل S5B، خط بالایی) و پپتیدهای دی پروپیله شده (ضمیمه SI، شکل S5B، خط پایین) شناسایی می شوند.این الگو با استفاده از پپتید N ترمینال NMPylated nsp9 تغییر می کند.در این مورد، فقط پپتیدهای پروپیله شده C ترمینال را می توان شناسایی کرد، اما پپتیدهای پروپیله شده ترمینال N و پپتیدهای دی پروپیله شده شناسایی نمی شوند (ضمیمه SI، شکل S5C)، که نشان می دهد UMP به آمین اولیه N-ترمینال برای جلوگیری از این امر منتقل شده است. گروه از ایجاد تغییرات

بعد، ما (با Ala یا Ser) را جایگزین یا حذف می کنیم تا باقیمانده های حفظ شده در انتهای N nsp9 را تعریف کنیم تا محدودیت های خاص هدف را تعریف کنیم.بر اساس داده‌های MS ما که نشان می‌دهد NiRAN یک ترکیب اضافی nsp9-NMP با آمین اولیه باقیمانده N ترمینال nsp9 تشکیل می‌دهد، ما فرض کردیم که nsp9 NMPylation به پروتئاز اصلی ویروسی (Mpro، nsp5) نیاز دارد تا ترمینال nsp9 N را آزاد کند. پیش ساز پلی پروتئین آنبرای آزمایش این فرضیه، ما یک پروتئین پیش‌ساز nsp7-11 حاوی nsp9 در E. coli تولید کردیم و یک آزمایش NMPylation استاندارد در حضور [α-32P] UTP (مواد و روش‌ها) انجام دادیم.همانطور که در شکل 5A (خط 3) نشان داده شده است، پیش ساز nsp7-11 برش نخورده با nsp12 نشاندار نشده است.در مقابل، اگر nsp7-11 توسط nsp5 نوترکیب جدا شود تا nsp9 (و سایر nsps) از پیش ساز آزاد شود، یک پروتئین نشاندار رادیویی که با nsp9 مهاجرت می‌کند شناسایی می‌شود و نتیجه ما را تایید می‌کند که NiRAN و N- تشکیل انتخابی ترکیب‌های افزایشی کووالانسی nsp9-NMP .آمین اولیه ترمینال Asn ترمینال N (موقعیت 3825 در pp1a/pp1ab).این نتیجه گیری همچنین توسط آزمایش هایی با استفاده از ساختار nsp9، که شامل یک یا دو باقی مانده اضافی در انتهای N است، پشتیبانی می شود.در هر دو مورد، UMPylation با واسطه NiRAN از nsp9 لغو شد (ضمیمه SI، شکل S7).در مرحله بعد، ما یک پروتئین با یک یا دو باقی مانده Asn حذف شده از توالی پپتیدی 3825-NNEIMPK-3832 در ترمینال N nsp9 تولید کردیم.در هر دو مورد، nsp9 UMPylation به طور کامل مسدود شد (شکل 5B)، که شواهد اضافی را ارائه می دهد که پایانه nsp9 N واقعی به عنوان یک گیرنده NMP عمل می کند.

پردازش پروتئولیتیک nsp9 و نقش باقیمانده های ترمینال N در UMPylation با واسطه nsp12.(الف) nsp9 UMPylation به یک ترمینال رایگان nsp9 N نیاز دارد.Nsp7-11-His6 از قبل در 30 درجه سانتیگراد در بافر تشخیص NMPylation حاوی UTP در حضور یا عدم حضور Mpro نوترکیب (nsp5-His6) انکوبه می شود.پس از 3 ساعت، سنجش NMPylation را با افزودن nsp12-His6 همانطور که در مواد و روش ها توضیح داده شده است، شروع کنید.واکنش حاوی nsp5-His6 (خط 1) و nsp9-His6 (خط 2) به عنوان کنترل استفاده شد.پس از 10 دقیقه، واکنش متوقف شد و مخلوط واکنش توسط SDS-PAGE جدا شد.پروتئین با Coomassie Brilliant Blue (A، بالا) رنگ آمیزی شد.پیش ساز Nsp7-11-His6 و محصول فرآوری شده حاصل از برش با واسطه nsp5-His6 در سمت راست نشان داده شده است.لطفاً توجه داشته باشید (به دلیل اندازه کوچک آنها) که nsp7 و nsp11-His6 در این ژل قابل تشخیص نیستند و واکنش با nsp5-His6 تکمیل می شود (خطوط 1 و 4؛ موقعیت nsp5-His6 با یک دایره جامد نشان داده شده است) یا nsp9-His6 (خط 2) حاوی مقدار کمی MBP (که با دایره های باز نشان داده شده است) به عنوان ناخالصی های باقی مانده است، زیرا آنها به عنوان پروتئین های همجوشی MBP بیان می شوند (ضمیمه SI، جدول S1).(ب) نوع Nsp9-His6 فاقد یک یا دو باقیمانده Asn ترمینال N (شماره‌گذاری باقیمانده بر اساس موقعیت در pp1a/pp1ab) است و با nsp12-His6 و [α-32P] UTP خالص و انکوبه می‌شود.B، SDS-PAGE رنگ آمیزی شده با Coomassie در بالا نشان داده شده است، B، اتورادیوگرافی مربوطه در پایین نشان داده شده است.موقعیت نشانگر وزن مولکولی (به کیلودالتون) در سمت چپ نشان داده شده است.(C) باقی‌مانده‌های حفظ‌شده پایانه‌ای HCoV-229E nsp9-His6 با Ala یا Ser جایگزین شدند، و همان مقدار پروتئین در واکنش UMPylation با واسطه nsp12-His6 استفاده شد.محصولات واکنش با SDS-PAGE جدا شدند و با Coomassie Brilliant Blue (C، بالا) رنگ‌آمیزی شدند و nsp9-His6 نشاندار شده با تصویربرداری فسفرسانس (C، وسط) شناسایی شد.با استفاده از پروتئین نوع وحشی (wt) به عنوان مرجع (تنظیم 100٪)، فعالیت NMPylation نسبی (میانگین ± SEM) از سه آزمایش مستقل محاسبه شد.(D) تیترهای ویروس در رویی کشت سلولی p1 سلول‌های Huh-7 آلوده به سلول‌های Huh-7 نوع وحشی HCoV-229E و جهش‌های حامل جایگزین‌های اسید آمینه تعیین‌شده در nsp9 با سنجش پلاک تعیین شد.موتیف RdRp با کمبود تکثیر C دو جهش یافته DD4823/4AA به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

انتهای N nsp9 (به ویژه موقعیت های 1، 2، 3 و 6) در بین اعضای زیرخانواده Orthocoronavirinae بسیار حفظ شده است (ضمیمه SI، شکل S6).به منظور مطالعه نقش احتمالی این باقیمانده ها در nsp9 NMPylation با واسطه nsp12، دو باقی مانده Asn متوالی در انتهای N nsp9 با Ala یا Ser (به تنهایی یا در ترکیب) جایگزین شدند.در مقایسه با nsp9 نوع وحشی، جایگزینی N3825 با Ala یا Ser منجر به کاهش بیش از دو برابری UMPylation با واسطه nsp12 شد (شکل 5C).مطابق با نتیجه گیری ما که NMPylation در آمین اولیه N ترمینال به جای زنجیره جانبی باقی مانده N ترمینال رخ می دهد، ما NMPylation باقی مانده قابل توجهی را با جایگزینی N3825A و N3825S مشاهده کردیم.جالب توجه است، اگر Asn دوم با Ala یا Ser جایگزین شود، nsp9 UMPylation شدیدتر کاهش می یابد (بیش از 10 برابر)، در حالی که جایگزینی Ala در موقعیت های 3، 4، و 6 تنها تأثیر متوسطی بر روی nsp9 UMPylation دارد (شکل 2). ) .5C).نتایج مشابهی با استفاده از ATP، CTP یا GTP به دست آمد (ضمیمه SI، شکل S8).در مجموع، این داده ها نقش کلیدی N2826 (موقعیت 2 در nsp9) را در NMPylation nsp9 نشان می دهد.

به منظور به دست آوردن شواهد اضافی از همبستگی عملکردی بین N-پایانه nsp9 و NMPylation، ما یک هم ترازی توالی چندگانه (MSA) از توالی nsp9 از خانواده کروناویروس (متغیر بین 104 و 113 باقیمانده) انجام دادیم (ضمیمه SI، شکل، شکل). S6).در مجموع، در 47 گونه (معروف و فرضی) از 5 جنس از زیرخانواده Orthocoronavirinae که پستانداران، پرندگان و میزبان خزندگان مختلف را آلوده می کنند، تنها 8 باقیمانده در مجموع ثابت شد.گسترده ترین تغییرات، از جمله حذف و درج، در چرخه بین عناصر ساختار ثانویه nsp9 مشاهده شد، همانطور که توسط مطالعات ساختاری قبلی تعیین شد (26 ??28).پنج باقی مانده ثابت در رشته β و مارپیچ α قسمت C ترمینال nsp9 پیدا شد.سه باقی مانده ثابت، موتیف NNE انتهای N nsp9 را تشکیل می دهند.مشخص شد که Asn دوم این موتیف تنها باقیمانده ثابت است که با nsp9 فرضی کروناویروس قورباغه از دور مرتبط نیز مشترک است و نشان دهنده گونه Microhyla letovirus 1 در زیرخانواده Letovirinae آلفالتوویروس است.حفاظت از باقی مانده در عناصر ساختار ثانویه nsp9 را می توان با ملاحظات ساختاری برای حفظ تاشو یا خواص اتصال RNA شناخته شده توجیه کرد.با این حال، به نظر نمی رسد این استدلال برای حفاظت از NNE صدق کند، و قبل از این مطالعه، ماهیت محدودیت هایی که تنوع توالی تری پپتیدی را محدود می کند، کاملاً مبهم بود.

به منظور تعیین اهمیت nsp9-NMPylation و حفاظت NNE در تکثیر ویروس کرونا، ما جهش‌های HCoV-229E را تولید کردیم که جایگزین‌های تک یا دوتایی باقی‌مانده‌های nsp9 N ترمینال را حمل می‌کنند، که نشان می‌دهد nsp9 NMPylation در شرایط آزمایشگاهی مضر است.قبل از شروع، ما سعی می کنیم به این سوال پاسخ دهیم که آیا این جانشینی ها (نزدیک محل برش nsp8|9) بر پردازش پروتئولیتیک ناحیه C ترمینال pp1a تأثیر می گذارد.مجموعه‌ای از ساختارهای پلی‌پروتئینی nsp7-11 حاوی جایگزین‌های مربوطه در انتهای N nsp9 در E. coli تولید و با Mpro نوترکیب برش داده شد.برش پروتئولیتیک چهار محل (از جمله سایت کناری nsp9) به طور قابل توجهی تحت تأثیر هیچ گونه جایگزینی معرفی شده قرار نمی گیرد (ضمیمه SI، شکل S9)، به استثنای تغییرات ساختاری در این پروتئین ها که با برش nsp8|9 با واسطه Mpro (یا موارد دیگر) تداخل دارند. سایت اینترنتی.

سلول های Huh-7 با RNA HCoV-229E طول ژنوم ترانسفکت شدند، که جایگزین های Ala یا Ser را در تری پپتیدهای حفظ شده NNE (N3825، N3826، و E3827) در انتهای nsp9 N کد می کند، که نشان می دهد اکثر جهش ها کشنده هستند.ما توانستیم ویروس را با جایگزین کردن Ser یا Ala از ترمینال N Asn (N2835A یا N2835S) نجات دهیم، اما نتوانستیم ویروس را با سایر جهش‌های منفرد و دوگانه در توالی NNE بازیابی کنیم (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS)، E3827A) (شکل 5D).

این نتایج نشان می‌دهد که تکثیر کروناویروس‌ها در کشت بافت محدود شده است (همان یا مشابه)، جهش طبیعی سایت‌های NMPylation nsp9 در بدن را محدود می‌کند و از نقش کلیدی این پاسخ در چرخه زندگی کروناویروس‌ها حمایت می‌کند.

در آخرین مجموعه آزمایش‌ها، ما C-terminal His6 با برچسب SARS-CoV-2 nsp12 و nsp9 و دو شکل جهش یافته از nsp12 در E. coli تولید کردیم.باقیمانده‌های سایت فعال در حوزه‌های NiRAN و RdRp به ترتیب Use Ala بودند (شکل 6A و پیوست SI، جدول S2).K4465 در SARS-CoV-2 nsp12 با K4135 در HCoV-229E مطابقت دارد (ضمیمه SI، شکل S2)، که ثابت شد برای فعالیت NiRAN و تکثیر HCoV-229E مورد نیاز است (شکل 3D و E).این باقیمانده همچنین با باقیمانده ویروس شریانی EAV nsp9 K94 مطابقت دارد که قبلاً نشان داده شده بود که برای NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation لازم است (16).همانطور که در شکل 6B نشان داده شده است، SARS-CoV-2 nsp12 دارای فعالیت UMP ترانسفراز با استفاده از nsp9 به عنوان یک بستر است، در حالی که جهش سایت فعال nsp12_K4465A غیرفعال است.جایگزینی مضاعف در توالی مشخصه SDD موتیف RdRp C بر فعالیت UMP ترانسفراز تأثیر نمی گذارد (شکل 6B)، که نشان می دهد فعالیت RdRp هیچ تأثیر مستقیمی در nsp9 UMPylation ندارد.داده های مشابه با استفاده از CTP، GTP و ATP به دست آمد (ضمیمه SI، شکل S10).به طور خلاصه، این داده ها نشان می دهد که nsp9 NMPylation با واسطه NiRAN دارای یک فعالیت محافظه کارانه در کروناویروس هایی است که جنس های مختلف زیرخانواده اورتوکوروناویروس را نشان می دهند.

NMPylation nsp9 با واسطه SARS-CoV-2 nsp12.(الف) ژل SDS-پلی آکریل آمید رنگ آمیزی شده توسط کوماسی که پروتئین نوترکیب مورد استفاده در تست NMPylation را نشان می دهد.به عنوان شاهد، یک پروتئین جهش یافته با جایگزینی سایت فعال در دامنه NiRAN (K4465A) و دامنه RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12 استفاده شد.شماره گذاری باقیمانده بر اساس موقعیت در pp1ab است.(ب) اتورادیوگرافی تشخیص UMPylation با استفاده از nsp9-His6 و [α-32P]UTP به عنوان بستر nsp12-His6 (نوع وحشی [wt] و جهش یافته).جرم مولکولی (بر حسب کیلودالتون) پروتئین نشاندار در سمت چپ نشان داده شده است.

دامنه های NiRAN به طور کلی در Nidovirales حفظ می شوند (16)، که نشان می دهد آنها واکنش های آنزیمی ضروری برای تکثیر Nidovirus را کاتالیز می کنند.در این مطالعه، ما توانستیم ثابت کنیم که دامنه NiRAN کروناویروس NMP (تولید شده از NTP) را به nsp9، یک پروتئین پیوند دهنده RNA مرموز که در تکثیر ویروس نقش دارد (26 ?? 29)، انتقال می دهد تا آن را به عنوان یک هدف طبیعی و تعیین کنیم. شریک کرونا RTC.

دامنه NiRAN سه موتیف توالی مشترک دارد (AN، BN، و CN)، که حاوی تعداد بسیار کمی از باقیمانده‌ها هستند که در همه خانواده‌ها در راسته Nidovirales تک‌فیلتیک اما بسیار متمایز نگهداری می‌شوند (8، 16).مطالعات اخیر نشان داده است که آنها از نظر ساختاری به یک خانواده عمدتاً نامشخص از پروتئین های شبه پروتئین کیناز مرتبط هستند که در ابتدا خانواده SelO نامیده می شدند (17، 19، 22، 30، 31).پروتئین‌های مرتبط با SelO دارای چین‌های کیناز هستند، اما فاقد چندین باقیمانده مکان فعال در کینازهای کلاسیک هستند (22، 32).بر اساس جهت‌گیری معکوس مولکول‌های ATP متصل به محل فعال و تثبیت شده توسط فعل و انفعالات خاص، فرضیه SelO مطرح شد و متعاقباً تایید شد که AMP (به‌جای فسفات) را به بستر پروتئین منتقل می‌کند (22)، در حالی که یکی دیگر از پروتئین‌های SelO مانند YdiU دارای اخیراً نشان داده شده است که اتصال کووالانسی UMP به Tyr و باقیمانده های او از سوبستراهای مختلف پروتئین را کاتالیز می کند (33).

به منظور تأیید و گسترش پیش‌بینی باقی‌مانده‌های سایت فعال احتمالی دامنه NiRAN کرونا، از روش‌های بیوشیمیایی و ژنتیک معکوس برای انجام آنالیز جهش بر روی ویروس کرونا nsp12 (شکل 3D و پیوست E و SI، شکل S3 و جدول) S1â استفاده کردیم. S4).داده‌ها نشان می‌دهند که جایگزینی HCoV-229E K4135، R4178 و D4280 با Ala، فعالیت NMP ترانسفراز و تکثیر ویروس را در محیط کشت سلولی حذف می‌کند (شکل 3D و ضمیمه‌های E و SI، شکل S3)، که از حضور آنها در NTP γ-فسفات حمایت می‌کند. (K4135، R4178) و هماهنگی یون های فلزی سایت فعال (D4280).جایگزینی E4145A از Glu حفظ شده در محدوده ویروس لانه پرنده برای تثبیت موقعیت K4135 (17) برای از بین بردن تکثیر ویروس نشان داده شد، اما به طور شگفت انگیزی، این فعالیت در سنجش NMPylation in vitro حفظ شد (شکل 3D و E و پیوست SI، شکل S3 و جداول S1-S4).مشاهدات مشابهی زمانی انجام شد که جایگزینی مربوطه در همولوگ YdiU سالمونلا تیفی موریوم (E130A) معرفی شد (33).روی هم رفته، این داده ها از عملکرد تنظیمی این باقیمانده حفاظت شده به جای تابع کاتالیزوری پشتیبانی می کنند.

جایگزینی باقی مانده Phe حفظ شده (F4281A) در محدوده نستوویروس در حوزه HCoV-229E NiRAN (8) منجر به کاهش فعالیت NMPylation در شرایط آزمایشگاهی و کاهش قابل توجهی در تکثیر ویروس در کشت سلولی شد (شکل 3D، E و SI). ضمیمه، شکل S3).داده ها با عملکرد نظارتی مهم این باقیمانده، مانند موتیف همولوگ DFG باقی مانده Phe که قبلا نشان داده شده است، مطابقت دارد.در پروتئین کینازهای کلاسیک، بخشی از حلقه اتصال Mg2+ است و به جمع آوری و تنظیم ستون فقرات کمک می کند؟??برای فعالیت کاتالیزوری موثر مورد نیاز است (32، 34).جایگزینی Ala و Arg برای باقیمانده‌های K4116 (در موتیف preAN)، به ترتیب، تکثیر ویروسی را حذف کرد و، همانطور که انتظار می‌رفت، اثرات متفاوتی بر فعالیت NMP ترانسفراز در شرایط آزمایشگاهی داشت، بسته به زنجیره جانبی اسید آمینه معرفی‌شده (شکل 3D و E و ضمائم SI). ، شکل S3).داده های عملکردی با اطلاعات ساختاری مطابقت دارد، که نشان می دهد این باقیمانده با فسفات ATP تعامل برقرار کرده است (17).در دامنه NiRAN سایر خانواده‌های ویروس تودرتو، موقعیت HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 توسط Lys، Arg یا His (8) اشغال شده است، که نشان می‌دهد محدودیت عملکردی این باقیمانده خاص کاهش یافته است.جایگزینی D4188A و D4283A باعث حذف یا کاهش شدید فعالیت آنزیم و حذف تکثیر ویروس می شود (شکل 3).این دو باقیمانده در اکثر ویروس‌های تودرتو (و نه همه) حفظ می‌شوند (۸)، که نشان‌دهنده یک عملکرد مهم خانواده خاص اما احتمالاً غیر کاتالیزوری است.جایگزینی Ala از چندین باقیمانده Lys و Asp دیگر (K4113A، D4180A، D4197A و D4273A) که در Coronaviridae یا سایر خانواده‌های Nestioviridae حفظ نشده‌اند (8) به عنوان شاهد استفاده شدند.همانطور که انتظار می رود، این جایگزینی ها تا حد زیادی قابل تحمل هستند، با کاهش جزئی در فعالیت آنزیم و تکثیر ویروس در برخی موارد (شکل 3 و ضمیمه SI، شکل S3).به طور کلی، داده‌های جهش‌زایی ویروس کرونا با داده‌های ژنتیکی خود-GMP و معکوس ژنتیک EAV NiRAN-RdRp (16) سازگار است، که در آن EAV nsp9 (اورتولوژی کروناویروس nsp12) K94 (مرتبط با HCoV-229E K4135) عملکردهای مهمی دارد. R124 (مربوط به R4178)، D132 (مرتبط با D4188)، D165 (مربوط به D4280)، F166 (مرتبط با F4281).علاوه بر این، داده‌های جهش‌زایی HCoV-229E با داده‌های ژنتیکی معکوس SARS-CoV قبلاً گزارش‌شده (16) مطابقت و گسترش یافته است، دقیقاً به همان اندازه که برای موتیف CN مربوطه Phe-to-Ala جهش یافته SARS-CoV_nsp12 مشاهده شده است. فنوتیپ توصیف شده -F219A و HCoV-229E_F4281A (شکل 3 D و E و پیوست SI، شکل S3 و جدول S1-S4).

در مقایسه با ارتولوگ‌های EAV (16)، که ترجیح واضحی برای UTP و GTP دارند (در واکنش NMPylation خود)، مطالعه ما نشان می‌دهد که دامنه NiRAN کروناویروس (نمایش‌دهنده HCoV-229E و SARS-CoV-2) می‌تواند به طور موثری باشد. هر چهار NMP را منتقل کرد، اگرچه ترجیح کمی برای UMP وجود دارد (شکل 1 و 3).ویژگی نسبتاً کم سوبسترای مشترک NTP با ساختار سوپرکامپوزیت SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 که اخیراً گزارش شده است، مطابقت دارد که در آن ADP-Mg2+ به محل فعال NiRAN متصل می شود، اما نه با قسمت آدنین. از شکل گیری تعاملات خاص (17).در مطالعه ما، نوع نوکلئوتید مورد استفاده در واکنش NMPylation هیچ تأثیری بر فعالیت پروتئین جهش یافته ندارد (ضمیمه SI، شکل S3)، که نشان می‌دهد هیچ یک از این باقیمانده‌ها ارتباط نزدیکی با اتصال یک نوکلئوباز خاص ندارند.اساس ساختاری و اهمیت بیولوژیکی بالقوه ترجیحات مختلف سوبسترای NTP مشاهده شده در حوزه‌های NiRAN کروناویروس‌ها و ویروس‌های شریانی باید مورد مطالعه قرار گیرد.آنها ممکن است درست باشند یا ممکن است به دلیل محدودیت های مطالعات مربوطه باشند.در حال حاضر، نمی توان رد کرد که فعالیت بالقوه NMPylator دامنه NiRAN ویروس شریانی (در مقایسه با فعالیت خود NMPylation که قبلا مشخص شده بود) ترجیح سوبسترای متفاوتی دارد، با در نظر گرفتن شباهت بین شریانی و ویروس کرونا. دامنه NiRAN در حد خود است.مقایسه مبتنی بر توالی (16).در مقایسه با pseudokinase SelO که از Mg2+ به عنوان کوفاکتور استفاده می کند، فعالیت ویروس کرونا و ویروس شریانی NiRAN به Mn2+ وابسته است (16) (شکل 3C و ضمیمه SI، شکل S1).وابستگی Mn2+ و ترجیح آشکار برای UTP یک ویژگی غیرمعمول پروتئین NMPylators است، و اخیراً در پروتئین YdiU سالمونلا تیفی موریوم تأیید شده است، که UMPylation وابسته به پروتئین وابسته به Mn2 را کاتالیز می کند تا از سلول ها در برابر استخر ATP سلولی القای استرس محافظت کند. 33).

شباهت ساختاری اخیراً بین دامنه NiRAN ویروس کرونا و پروتئین کینازهای سلولی (17، 19) پشتیبانی بیشتری از توانایی NiRAN در پیوند کووالانسی NMP با سایر پروتئین‌هایی که در این مطالعه گزارش کرده‌ایم، فراهم می‌کند.ما جستجوی خود را برای اهداف احتمالی NiRAN روی پروتئین‌های کدگذاری شده توسط HCoV-229E ORF1a متمرکز کردیم، که به طور مستقیم یا غیرمستقیم به replicase رمزگذاری‌شده با ORF1b RTC کمک می‌کنند (12، 35).آزمایشات ما شواهد قطعی برای NMPylation موثر و اختصاصی nsp9 ارائه می دهد (شکل 2).اگر پروتئین هدف در مقدار اضافی مولی 8 تا 10 برابر بیشتر از آنزیم (nsp12) استفاده شود، تأیید می شود که nsp9 کاملاً (مونو) NMP شده است (شکل 4).ما به این نتیجه رسیدیم که تعامل بین nsp12 و nsp9 کوتاه مدت است و یک کمپلکس پایدار با nsp9 تشکیل نخواهد داد (در غیاب سایر زیر واحدهای RTC).این نتیجه گیری توسط مطالعات برهمکنش پروتئین بر روی پروتئوم SARS-CoV (35) پشتیبانی می شود.تجزیه و تحلیل MS آمین اولیه باقیمانده N ترمینال nsp9 را به عنوان محل NMPylation شناسایی کرد (ضمیمه SI، شکل S5).تشکیل پیوند فسفورامیدات و گروه آمینه N ترمینال، فعالیت NMPylation با واسطه NiRAN را از واکنش AMPylation با واسطه SelO با واسطه Pseudomonas syringae متمایز می کند، که تشکیل AMP متصل به O را در ترکیب اضافی پپتیدی باقیمانده Ser، Thr یا Tyr کاتالیز می کند. 22)، و S. typhimurium YdiU ترکیبات افزایشی پپتیدی-UMP متصل به O (با Tyr) و N (با His) را تشکیل می دهد.اطلاعات محدود موجود در مورد خانواده پروتئین های SelO نشان می دهد که اعضای این خانواده پروتئینی بزرگ در تشکیل ترکیب های افزایشی پپتید-NMP تفاوت زیادی دارند.این یک مشاهده جالب است که شایسته مطالعه بیشتر است.

داده‌های به‌دست‌آمده در این مطالعه ما را به این فرضیه سوق داد که NMPylation nsp9 به یک پایانه N آزاد نیاز دارد.در زمینه تکثیر ویروسی، این توسط برش پروتئولیتیک محل پردازش nsp8|nsp9 در پلی پروتئین pp1a کپی با واسطه Mpro و pp1ab ارائه می شود.در اکثر کروناویروس‌ها، تفاوت بین این سایت خاص (VKLQ|NNEI در HCoV-229E) و سایر مکان‌های برش کروناویروس Mpro در Asn است (به جای باقی‌مانده کوچک دیگری مانند Ala، Ser یا Gly) که P1â را اشغال می‌کند؟??مکان (36).داده‌های برش پپتیدی به‌دست‌آمده در مطالعات اولیه نشان داد که راندمان برش سایت nsp8|nsp9 کمتر از سایر سایت‌ها بود، که نشان می‌دهد 1) این سایت خاص ممکن است نقش نظارتی در پردازش هماهنگ به‌موقع ترمینال C داشته باشد. منطقه pp1a، یا 2) نقش پایانه N nsp9 حفاظت شده ویژه در تکثیر ویروس (37).داده های ما (شکل 5A) نشان داد که شکل نوترکیب nsp9 حامل توالی N ترمینال واقعی به طور موثر توسط nsp12 NMP شده است.توالی طرفین ترمینال N توسط فاکتور Xa (nsp9-His6؛ ضمیمه SI، جدول S1) یا برش با واسطه Mpro (nsp7-11-His6؛ شکل 5A و ضمیمه SI، جدول S1) حذف شد.نکته مهم این است که پیش ساز nsp7-11-His6 حاوی nsp9 برش نخورده مقاومت در برابر NMPylation nsp12 نشان داد که با داده های ما مطابقت دارد و نشان می دهد که ترکیب اضافی nsp9-NMP از طریق آمین اولیه N ترمینال تشکیل شده است (ضمیمه SI، شکل S5) .برای به دست آوردن درک عمیق تر از ویژگی بستر NiRAN، سپس بر روی باقی مانده های ترمینال N مجاور nsp9 تمرکز کردیم.در غیاب سایر پروتئین‌ها، آنها از نظر ساختاری انعطاف‌پذیر هستند و از شناسایی آن‌ها به شکل بدون برچسب nsp9 جلوگیری می‌کنند (26 28، 38)، که نشان‌دهنده تنوع طبیعی محدود آنهاست. عملکرد قطعه N ترمینال nsp9.جایگزینی Ala باقیمانده های حفاظت شده در این ناحیه (شکل 5C و D و ضمیمه SI، شکل S8) نشان می دهد که N3826 برای nsp9 NMPylation در شرایط آزمایشگاهی ضروری است، در حالی که جایگزینی N3825A و E3827A منجر به کاهش NMPylation می شود، در حالی که M3829A و P38 جایگزین نمی شوند. .بدیهی است که nsp9 NMPylation را تحت تاثیر قرار می دهد.اگرچه جایگزینی Asn ترمینال N (N3825A, N3825S) تنها تأثیر متوسطی بر NMPylation nsp9 و تکثیر ویروس در کشت سلولی دارد (شکل 5C و D)، حذف یک توالی باقیمانده Asn از دی پپتید N ترمینال 3825-NN ثابت شده است که برای ویروس ها کشنده است، که نشان می دهد یک باقیمانده Asn قبل از باقیمانده دیگری در انتهای N، ترجیحا Asn مورد نیاز است، اگرچه به نظر می رسد که جایگزینی باقی مانده های مشابه تا حدی قابل تحمل باشد (شکل 5B، C و D).نتیجه می گیریم که دی پپتید 3825-NN، به ویژه باقیمانده N3826 حفاظت شده و ضروری در محدوده ویروس کرونا (ضمیمه SI، شکل S6)، اتصال و جهت گیری صحیح انتهای N nsp9 در محل فعال NiRAN را تضمین می کند.

جایگزینی Ala (E3827A) به‌جای Glu حفاظت‌شده همه زیرخانواده‌ها، nsp9 NMPylation را در شرایط آزمایشگاهی حفظ می‌کند، اما برای ویروس‌ها در کشت سلولی کشنده است (شکل 5C و D)، که نشان‌دهنده عملکرد اضافی این باقیمانده است، به عنوان مثال، در فعل و انفعالات کلیدی (NMPylated یا اصلاح نشده). ) nsp9 N-پایانه و سایر عوامل دخیل در تکثیر ویروس.جهش‌های Nsp9 بر فرآیند پروتئولیتیک nsp9 یا هر nsps مجاور تأثیری نداشت (39) (ضمیمه SI، شکل S9)، که نشان می‌دهد فنوتیپ‌های کشنده چندین جهش nsp9 مشاهده‌شده توسط بی‌نظمی در ناحیه pp1a فرآیند پروتئولیتیک C ایجاد نشده‌اند. .

داده‌های بالا شواهدی را ارائه می‌دهند که پس از درمان با واسطه Mpro از محل برش nsp8|9 در pp1a/pp1ab، انتهای N nsp9 می‌تواند UMPylated شود (یا تا حدی با NMP دیگری اصلاح شود).علاوه بر این، حفاظت عالی از انتهای N nsp9 (شامل باقی مانده‌های Asn منفرد و ثابت در خانواده کروناویروس) و داده‌های ژنتیکی معکوس به‌دست‌آمده در این مطالعه (شکل 3E و 5D) ما را به این نتیجه رساند که NMPylation nsp9 توصیف‌شده از نظر بیولوژیکی مرتبط است و برای تکثیر ویروس کرونا ضروری است.پیامدهای عملکردی این اصلاح همچنان باید مورد مطالعه قرار گیرد، به عنوان مثال، در رابطه با فعالیت اتصال RNA nsp9 (غیر اختصاصی) قبلاً شرح داده شده (غیر اختصاصی) (شکل اصلاح نشده) (2628).NMPylation N ترمینال همچنین ممکن است بر تعامل nsp9 با سوبستراهای پروتئین یا RNA یا تشکیل مجموعه های مختلف چهار سطحی تأثیر بگذارد.این موارد در مطالعات ساختاری مشاهده شده‌اند و تایید شده‌اند که از نظر عملکردی با تکثیر کروناویروس مرتبط هستند، اگرچه به ویژه در صورت عدم وجود این اصلاح (26- â29, 40).

اگرچه ویژگی هدف دامنه NiRAN ویروس کرونا هنوز باید با جزئیات بیشتری مشخص شود، داده‌های ما نشان می‌دهد که ویژگی هدف پروتئین دامنه NiRAN ویروس کرونا بسیار باریک است.اگرچه حفظ باقیمانده‌های سایت فعال کلیدی (8، 16) در دامنه NiRAN همه خانواده‌های nidovirus به شدت از فعالیت این پروتئین‌های NMPylator حفاظت‌شده پشتیبانی می‌کند، هویت باقی‌مانده‌های پاکت اتصال سوبسترای این دامنه حفظ و نگهداری باقی مانده است که مشخص شود. ، و ممکن است بین خانواده های مختلف اهداف Nidovirales متفاوت باشد.به طور مشابه، اهداف مربوط به سایر ویروس‌های تودرتو هنوز مشخص نشده است.آنها ممکن است ارتولوگ های دور nsp9 یا پروتئین های دیگر باشند، زیرا توالی های خارج از پنج حوزه replicase که عموماً در ویروس های تودرتو حفظ می شوند، کمتر حفاظت شده اند (8) از جمله آرایه ژنوم بین Mpro و NiRAN، در میان آنها، nsp9 در ویروس کرونا.

علاوه بر این، در حال حاضر نمی‌توانیم این احتمال را که دامنه NiRAN دارای اهداف اضافی (از جمله سلولی) باشد را رد کنیم.در این مورد، شایان ذکر است که همولوگ های باکتریایی در این NMPylators پروتئین (NMPylators) (30، 31) به نظر می رسد "تنظیم کننده های اصلی" دارند؟NMP انواع پروتئین های سلولی را تعدیل می کند تا فعالیت های پایین دستی آنها را تنظیم یا حذف کند، در نتیجه در انواع فرآیندهای بیولوژیکی، مانند پاسخ استرس سلولی و هموستاز ردوکس، نقش ایفا می کند (22، 33).

در این مطالعه (شکل‌های 2 و 4 و پیوست SI، شکل‌های S3 و S5)، ما توانستیم ثابت کنیم که nsp12 بخش UMP (NMP) را به یک موقعیت واحد (حفظ‌شده) در nsp9 منتقل می‌کند، در حالی که سایر پروتئین‌ها در nsp9 اصلاح نشده‌اند. تحت شرایط مورد استفاده قرار می گیرد، ویژگی بستر کاملاً تعریف شده (به جای شل) پشتیبانی می شود.مطابق با این، در مقایسه با NMPylation nsp9 N ترمینال، فعالیت NMPylation خود nsp12 بسیار کم است، تشخیص آن به زمان قرار گرفتن در معرض اتورادیوگرافی طولانی تری نیاز دارد و افزایش 10 برابری در غلظت nsp12 استفاده می شود.علاوه بر این، تجزیه و تحلیل MS ما نتوانست شواهدی برای NMPylation nsp12 ارائه کند، که نشان می‌دهد خود NMPylation دامنه NiRAN (در بهترین حالت) یک فعالیت ثانویه است.با این حال، لازم به ذکر است که مطالعات دیگر شواهد اولیه ای را ارائه کرده اند که نشان می دهد وضعیت خود-AMPylation NMPylator باکتریایی ممکن است فعالیت NMPylation آنها را روی سایر سوبستراهای پروتئینی کنترل کند (22، 33).بنابراین، تحقیقات بیشتری برای بررسی اثرات عملکردی احتمالی فعالیت‌های خود NMPylation گزارش شده برای EAV nsp9 (16) و nsp12 کروناویروس (این مطالعه) مورد نیاز است، از جمله اثر شبه چپر پیشنهادی بر روی تا شدن دامنه RdRp ترمینال C. 16)).

پیش از این، چندین فرضیه در مورد عملکردهای احتمالی پایین دست دامنه NiRAN nidoviral، از جمله RNA لیگاز، ترانسفراز گوانیلات با پوشش RNA و فعالیت اولیه پروتئین (16) در نظر گرفته شده است، اما هیچ یک از آنها با توابع پایین دست موجود سازگار نیستند.اطلاعات به دست آمده در موقعیت های زیر دقیقاً همان زمان است بدون اینکه فرضیات اضافی ایجاد شود.داده‌های به‌دست‌آمده در این مطالعه با (اما نمی‌تواند ثابت کند) که دامنه NiRAN در شروع سنتز RNA ناشی از پروتئین دخیل است، سازگار است.قبلاً اعتقاد بر این بود که عملکرد دامنه NiRAN در 5??پوشش 2-RNA یا واکنش های بستن RNA تحت تأثیر این و پشتیبانی از داده های دیگر قرار نمی گیرد.بنابراین، برای مثال، سایت فعال NiRAN در نظر گرفته می‌شود که Asp حفاظت‌شده را به‌عنوان یک پایه کلی درگیر کند (D252 در Pseudomonas syringae SelO؛ D4271 در HCoV-229E pp1ab؛ D208 در SARS-CoV-2 nsp12) (ضمیمه SI، شکل 2) ).S2) (17، 22، 33)، در حالی که کاتالیز در لیگاز RNA وابسته به ATP و آنزیم پوشاننده RNA توسط آنزیم کووالانسی-(lysyl-N)-NMP انجام می شود، که شامل یک باقیمانده Lys غیر تغییر یافته است. 41).علاوه بر این، ویژگی قابل‌توجه مبتنی بر توالی ویروس NiRAN برای اهداف پروتئینی حفاظت‌شده و ویژگی آرام برای سوبستراهای NTP (ترجیح UTP) با آنزیم پوشاننده با واسطه NiRAN یا عملکردهای شبه RNA لیگاز مخالف است.

بدیهی است که برای تأیید و در صورت اثبات، توضیح بیشتر در مورد نقش احتمالی nsp9-UMP (nsp9-NMP) در سنتز RNA ناشی از پروتئین، به کار اضافی زیادی نیاز است، که چندین گزارش جالب اما (تاکنون) را که قبلا گزارش شده است به هم متصل می کند. .مشاهدات مجزابه عنوان مثال، مشخص شده است که انتهای RNA رشته منفی ویروس کرونا با یک رشته اولیگو(U) شروع می شود (42، 43).این مشاهدات با این ایده مطابقت دارد که سنتز RNA رشته منفی با اتصال شکل UMPylated nsp9 به دم پلی (A) (محرک‌ها) آغاز می‌شود، که ممکن است توسط اتصال RNA آن تقویت شود. فعالیت و/یا تعامل با پروتئین RTC دیگربخش UMP ارائه شده توسط nsp9 سپس می تواند به عنوان یک "پرایمر" برای الیگوریدیلاسیون با واسطه nsp7/8/nsp12، با استفاده از دم 3??²-poly(A) در RNA ژنومی یا توالی دیگری حاوی الیگو (A) استفاده شود. به عنوان یک الگو عمل می کند، شبیه به مکانیسم ایجاد شده برای پروتئین VPg picornavirus (44).اگر پیشنهاد "غیر هنجاری" باشد چه؟???شروع سنتز RNA رشته منفی (القای پروتئین) پیوندی را به مشاهدات ارائه می دهد، که نشان می دهد RNA رشته منفی کروناویروس دارای UMP (به جای UTP) در انتهای خود است (42)، که نشان دهنده این است که اسید نوکلئیک دایسر انتهای فسفریله شده توسط اندونوکلئاز ناشناخته مخصوص یوریدین را می شکافد.در صورت تایید، این فعالیت هیدرولیتیک اسید نوکلئیک می تواند به آزادسازی فرم UMPylated الیگومری nsp9 از انتهای 5 مربعی رشته منفی نوپا کمک کند.نقش احتمالی nsp9 در پرایمینگ پروتئین نیز مطابق با مطالعات قبلی ژنتیک معکوس است، که نشان داده است nsp9 (و nsp8) به طور انتقادی و به طور خاص با عنصر RNA فعال سیس در نزدیکی انتهای 3 ژنوم کرونا تعامل دارند.45).بر اساس این گزارش، اکنون می توان این مشاهدات قبلی را با تحقیقات بیشتر مورد بررسی مجدد قرار داد و گسترش داد.

به طور خلاصه، داده‌های ما فعالیت خاص یک برچسب آنزیم ویروس تودرتو اختصاصی مرتبط با RdRp در انتهای N را تعیین کرد.در ویروس کرونا، این فعالیت UMPylator/NMPylator با واسطه NiRAN که به تازگی کشف شده است برای تکیه بر Mn2+ و باقیمانده‌های Asn مجاور و ایجاد پیوندهای فسفورامیدات (کم انرژی) با آمین اولیه N ترمینال استفاده می‌شود.از طریق برش با واسطه Mpro در محل برش nsp8|9، هدف nsp9 می تواند برای NMPylation استفاده شود، که نشان دهنده جفت شدن عملکردی بین پروتئاز و دامنه NiRAN است که تا RdRp گسترش می یابد.حفاظت از باقیمانده‌های کلیدی در سایت فعال nsp12 NiRAN و هدف nsp9، همراه با داده‌های به‌دست‌آمده از دو ویروس کرونا از جمله SARS-CoV-2، شواهد محکمی را ارائه می‌دهد که نشان می‌دهد nsp9 NMPylation یک ویروس کرونا است ویژگی‌های محافظه‌کار نیز گامی کلیدی در تکثیر ویروس هستند.داده‌های موجود ما را به این نتیجه می‌رساند که نقش خاص شکل NMPylated nsp9 در سنتز RNA ناشی از پروتئین یک سناریوی معقول برای کرونا و سایر ویروس‌های تودرتو است و NiRAN ممکن است پروتئین‌های ناشناس دیگر را نیز هدف قرار دهد.ویروس را تنظیم کنید.تعامل میزباندر صورت تایید، دخالت پرایمرهای پروتئینی در سنتز RNA ویروسی، میل ترکیبی توالی دامنه‌های Mpro/3CLpro و RdRp را بین سوپرگروه کروناویروس شناسایی‌شده قبلی و شبه پیکورناویروس (9) افزایش می‌دهد، که اکنون در Pisonivirites اخیراً ایجاد شده‌اند. 46) در دسته بندی.

داده های ما همچنین نشان می دهد که فعالیت های آنزیمی پایه، انتخابی و محافظه کار شناسایی شده در این مطالعه می تواند به عنوان اهدافی برای داروهای ضد ویروسی استفاده شود.ترکیباتی که با اتصال (و اصلاح بعدی) nsp9 N-پایانه حفاظت شده در محل فعال NiRAN تداخل می کنند، می توانند به داروهای ضد ویروسی موثر و همه کاره، مناسب برای درمان کروناویروس های حیوانی و انسانی از عفونت های (زیر) مختلف تبدیل شوند. از جمله SARS-CoV-2 و کروناویروس سندرم تنفسی خاورمیانه.

توالی کدکننده پروتئین کروناویروس تولید شده در این مطالعه با RT-PCR با استفاده از RNA جدا شده از Huh-7 آلوده به HCoV-229E یا Vero E6 آلوده به SARS-CoV-2، تکثیر شد و با استفاده از روش‌های شبیه‌سازی استاندارد درج شد.pMAL-c2 (آزمایشگاه بیولوژیکی نیوانگلند) یا ناقل بیان pASK3-Ub-CHis6 (47) (ضمیمه SI، جداول S1 و S2).جایگزینی های تک کدون با جهش زایی مبتنی بر PCR معرفی شدند (48).برای تولید پروتئین فیوژن MBP، سلول های E. coli TB1 با ساختار پلاسمید pMAL-c2 مناسب تبدیل شدند (ضمیمه SI، جدول S1).پروتئین فیوژن با کروماتوگرافی میل ترکیبی آمیلوز خالص شد و با فاکتور Xa جدا شد.متعاقباً، پروتئین C ترمینال دارای برچسب His6 توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی فلزی بی حرکت با نیکل (Ni-IMAC) همانطور که قبلاً توضیح داده شد خالص شد (49).برای تولید پروتئین همجوشی یوبیکوئیتین، سلول‌های E. coli TB1 از ساختار پلاسمید pASK3-Ub-CHis6 مناسب (ضمیمه SI، جداول S1 و S2) و DNA پلاسمید pCGI که ​​هیدرولاز C ترمینال اختصاصی یوبیکوئیتین 1 (Ubp1) را کد می‌کند، استفاده کردند.تبدیل (47).پروتئین کروناویروس با برچسب His6 ترمینال C همانطور که قبلاً توضیح داده شد خالص شد (50).

تست self-NMPylation HCoV-229E nsp12-His6 همانطور که در EAV nsp9 توضیح داده شد انجام شد (16).به طور خلاصه، nsp12-His6 (0.5 میکرومولار) حاوی 50 میلی مولار 4-(2-هیدروکسی اتیل)-1-پیپرازین اتان سولفونیک اسید (HEPES)-KOH، pH 8.0، 5 میلی مولار دی تیوتریتول (DTT)، 6 میلی مولار MnCl2، 25 میکرومولار بافر، 25 میکرومولار بافر NTP مشخص شده و 0.17 میکرومولار [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol؛ Hartmann Analytic) در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه مطابقت داشتند.در سایر سنجش های NMPylation (استاندارد) nsp9 NMPylation با واسطه nsp12، شرایط واکنش به شرح زیر تنظیم می شود: nsp12-His6 (0.05 میکرومولار) و nsp9-His6 (4 میکرومولار) در حضور 50 میلی مولار HEPES-KOH (pH 8.0). )، 5 میلی مولار DTT، 1 میلی مولار MnCl2، 25 میکرومولار نشان دهنده NTP، و 0.17 میکرومولار مطابق [α32-P]NTP است.پس از انکوباسیون به مدت 10 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی گراد، نمونه واکنش با بافر نمونه SDS-PAGE مخلوط شد: 62.5 میلی مولار تریس (هیدروکسی متیل) آمینو متان HCl (pH 6.8)، 100 میلی مولار DTT، 2.5٪ SDS، 10٪ گلیسرول و 0.005٪ بروموفنول. آبی.پروتئین با حرارت دادن در دمای 90 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه دناتوره شد و با 12% SDS-PAGE جدا شد.ژل با محلول Coomassie Brilliant Blue (40٪ متانول، 10٪ اسید استیک، 0.05٪ Coomassie Brilliant Blue R-250) ثابت و رنگ آمیزی می شود، رنگ زدایی می شود و به مدت 20 ساعت در معرض صفحه تصویربرداری فسفری قرار می گیرد (برای تشخیص nsp12 از NMPylation) یا (حداکثر) 2 ساعت (برای ارزیابی nsp9 NMPylation).تصویرگر Typhoon 9200 (GE Healthcare) برای اسکن صفحه و ImageJ برای تجزیه و تحلیل شدت سیگنال استفاده شد.

برای تجزیه و تحلیل MS، 1 میکرومولار nsp12-His6 و 10 میکرومولار nsp9 (بدون برچسب هگزا هیستیدین) در تجزیه و تحلیل NMPylation (ضمیمه SI، جدول S1) و غلظت افزایش یافته 500 میکرومولار UTP و GTP استفاده شد.بسته به غلظت و کیفیت پروتئین مورد انتظار، یک سیستم HPLC Waters ACQUITY H-Class مجهز به ستون MassPrep (Waters) برای نمک زدایی 1 تا 10 میکرولیتر از محلول های پروتئین بافر به صورت آنلاین استفاده شد.پروتئین نمک زدایی شده به منبع یون الکترواسپری طیف سنج جرمی Synapt G2Si (آب ها) از طریق گرادیان زیر از بافر A (آب / 0.05٪ اسید فرمیک) و بافر B (استونیتریل / 0.045٪ اسید فرمیک) شسته می شود و دمای ستون برابر است. 60 درجه سانتیگراد و سرعت جریان 0.1 میلی لیتر در دقیقه: شستشوی ایزوکراتیک با 5% A به مدت 2 دقیقه، سپس یک گرادیان خطی تا 95% B در عرض 8 دقیقه، و 95% B را برای 4 دقیقه دیگر حفظ کنید.

یون های مثبت با محدوده جرمی 500 تا 5000 m/z شناسایی می شوند.Glu-fibrinopeptide B هر 45 ثانیه برای تصحیح رانش جرم به طور خودکار اندازه گیری می شود.از نرم‌افزار ابزار MassLynx با پسوند MaxEnt1 استفاده کنید تا پس از کسر خط پایه و هموارسازی، طیف میانگین را جدا کنید.

UMPylated HCoV-229E nsp9 با افزودن تریپسین اصلاح شده با درجه توالی (Serva) هضم شد و یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد.یک ستون چرخشی Chromabond C18WP (شماره قطعه 730522؛ Macherey-Nagel) برای نمک زدایی و تغلیظ پپتیدها استفاده شد.در نهایت، پپتید در 25 میکرولیتر آب که حاوی 5 درصد استونیتریل و 0.1 درصد اسید فرمیک بود، حل شد.

نمونه‌ها با استفاده از طیف‌سنج جرمی Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific) توسط MS آنالیز شدند.سیستم HPLC نهایی نانو (Dionex)، مجهز به 50 سانتی متری که در انتهای آن نصب شده است.ستون 75 میکرومتر C18 RP پر شده با مهره های مغناطیسی 2.4 میکرومتر (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) از طریق منبع نانو اسپری Proxeon به طیف سنج جرمی آنلاین متصل شوید.6 میکرولیتر محلول هضم تریپسین را به قطر داخلی 300 میکرومتر تزریق کنید.ستون پیش تغلیظ 1 سانتی متری C18 PepMap (Thermo Scientific).با استفاده از آب / 0.05٪ اسید فرمیک به عنوان حلال، نمونه به طور خودکار به دام افتاده و با سرعت جریان 6 میکرولیتر در دقیقه نمک زدایی شد.

گرادیان های زیر آب/0.05% اسید فرمیک (حلال A) و 80% استونیتریل/0.045% اسید فرمیک (حلال B) برای دستیابی به جداسازی پپتیدهای تریپتیک با سرعت جریان 300 nL/min استفاده شد: 4% B برای 5 دقیقه، سپس 30 A گرادیان خطی به 45٪ B در عرض چند دقیقه، و افزایش خطی به 95٪ حلال B در عرض 5 دقیقه.ستون کروماتوگرافی را به یک نانو امیتر فولاد ضد زنگ (Proxeon) وصل کنید و مایع شوینده را با استفاده از پتانسیل 2300 ولت مستقیماً به مویرگ گرم شده طیف سنج جرمی اسپری کنید. اسکن بررسی با وضوح 60000 در تحلیلگر جرم Orbitrap مرتبط است. با حداقل سه اسکن داده MS/MS، به مدت 30 ثانیه به صورت پویا حذف شده است، با استفاده از تفکیک ناشی از برخورد تله یون خطی یا تفکیک برخورد انرژی بالاتر همراه با تشخیص مدارگرد، وضوح 7500 است.